光學顯微鏡的空間分辨率是經過光學系統后能區分物上兩點之間的最小距離。

這個距離在空間上依據所處平面的不同通常分為橫向分辨率(lateral resolution)及軸向分辨率(axial resolution)，橫向分辨率指物面上可分辨的最小距離，軸向分辨率則指在垂直物面方向上可分辨的最小距離。以物面上理想點光源對應像面的艾里斑為例，如果兩個物點彼此遠離，很容易將它們分辨為單獨的對象。隨著兩個物點對應像面上艾里斑之間的距離逐漸減小，艾里斑逐漸重疊，當一個艾里斑的中央主極大值與另一艾里斑的第一極小值重疊時，認為是可分辨兩個艾里斑的最小距離，這個極限被稱為瑞利判據(Rayleigh Criterion)，如圖1所示。

?瑞利判據圖示

可分別得出對應的橫向分辨率計算公式：

其中，λ 代表成像光的波長，NA為使用的物鏡的數值孔徑。

分辨率大小的評判較為主觀，常用的分辨率大小計算判據除了經典的瑞利判據以外，還有兩種常見判據：阿貝(Abbe)判據和斯派羅(Sparrow)判據。

其中阿貝判據對應的分辨率定義為：

橫向分辨率：

軸向分辨率：

斯派羅判據對應的分辨率定義如下：

在光學顯微系統中影響空間分辨率的主要因素是物鏡的數值孔徑，但是分辨率還取決于樣本種類，照明的相干性，像差校正的程度以及其他因素。