在臨床實踐中，病理學檢測通常需要化學染色等多個繁雜步驟且成本昂貴，在術中病理檢測等應用中存在極大的局限性。利用高光譜顯微成像技術，不僅可對病理組織切片進行無損和快速成像，還可采集到病理組織切片豐富的光譜信息，在對高光譜顯微圖像進一步數據處理后，可獲取關于病理組織切片的生理、生化信息，進而實現快速、準確的病理診斷。高光譜顯微成像技術具有圖譜合一的特點，避免了化學染色法對組織樣本的傷害，不影響標本進行其它檢測。本文主要介紹了高光譜顯微成像技術及其發展趨勢，其中著重闡述了一種新型的可編程高光譜顯微成像技術及其所實現的光學染色功能，隨后重點介紹了高光譜顯微成像技術在病理學檢測中的應用現狀。

高光譜病理檢測主要是通過組織活檢，即采用鉗取、穿刺、局部切除等方式，從患者病變處獲取病變組織進行病理診斷的一種方法。通過固定、取材、包埋、切片、染色等一系列方法制作出病理切片，由病理醫師通過大體觀察組織學和細胞學鏡下觀察，結合組織化學、免疫組織化學等觀察方法，來綜合對病變做出病理診斷。病理檢查主要是為了明確病變性質，及時做出準確的病理診斷，為臨床治療、評估預后提供重要的理論依據。病理診斷比臨床上單純根據病史、癥狀和體征做出的分析性診斷，以及利用各種影像做出的診斷，更具有客觀性和準確性。

在臨床病理檢測中常常需要染色來獲得病理切片，而傳統化學染色方法步驟繁雜且成本十分昂貴，耗時長，其每一個步驟和環節都可能影響最終檢測結果。尤其在化學染色中由于固定劑類型不合適 [2]，染色試劑不適當 和切片機性能較差等產生的問題均會對檢測結果產生巨大影響。另外，在實際臨床病理工作中，常遇到經一種染色后不能確診進而需要進一步標記的情況，然而染色后的樣本通常難以重復利用或需褪色后再行染色等復雜操作。高光譜顯微成像技術，利用所采集到的病理組織切片豐富的光譜信息并經進一步數據處理后，可獲取關于病理組織切片的生理、生化信息，進而實現快速、準確的病理診斷，可有效避免化學染色法對組織樣本的傷害。近年來隨著高光譜顯微成像技術的日趨成熟，其在病理檢測中的應用也逐漸成為人們研究的熱點。此外，本文還進一步闡述了一種新型的可編程高光譜顯微成像技術及其所實現的光學染色功能。與傳統化學染色方法對比，光學染色由于沒有使用染色劑進行操作，減少了操作過程中造成的圖像誤差并保留完整標本，而且成像速度上有大幅度提高，進一步提高了高光譜顯微成像技術在臨床病理檢測中的應用范圍。

高光譜顯微成像技術

高光譜顯微技術將高光譜成像和生物顯微鏡相結合，由于高光譜成像技術光譜分辨率高、光譜波段多、圖譜合一，近年來得到了廣泛的應用。與傳統顯微成像相比，它可對生物組織切片同時獲取目標的形態圖像信息和光譜信息，提供更多維度的信息進行病理分析，輔助醫生和醫學研究者從另一個角度研究生物切片。

高光譜顯微成像系統主要由成像光譜儀、CCD相機和顯微鏡三部分組成。它可按照多種不同的分類標準進行分類，例如工作波段有紫外、紅外、可見光等;測量光譜的類型有反射光譜、熒光光譜、拉曼光譜等;光譜色散方式有棱鏡、光柵等;采集高光譜數據方式有掃描式和快照式等。本文將按照采集高光譜數據方式分別介紹掃描式、快照式高光譜顯微成像技術和一種新型的可編程高光譜顯微成像技術。

①掃描式高光譜顯微成像技術

三種成像方式特點擺掃式成像方式來自于遙感獲取數據的過程，當獲取事物反射光譜數據時，需調整光路接收光譜信息，由于其內部的小鏡片掃描的方向垂直于飛行路徑，兩個方向上的空間掃描一次只能收集單個像素，因此這種采集高光譜數據的方式也被稱為逐點掃描。結合顯微成像，需要在水平方向上移動樣本或者移動掃描位置來變換目標像素點，如圖1(a)所示，所以這種系統的硬件上更加復雜，在采集數據方面消耗時間較長，且效率比較低，實用性比較差。

推掃式成像也被稱為線性掃描，空間兩個維度信息通過自掃描和平臺運動實現，視場內的光信號依次經過物鏡、入射狹縫和準直模塊、色散元件，并成像于CCD相機 [4]。推掃式和擺掃式一樣都需要解決幀同步和圖像拼接的問題。考慮到顯微成像對外界擾動敏感，上述兩種機械掃描都需要額外的防震設施 [5]。與擺掃式不同是推掃式光譜成像一次掃描不是以點為單位，而是以列為單位采集像素點的空間信息和光譜信息，如圖1(b)所示，所以采集的時間效率更高，圖像的光譜分辨率和空間分辨率也會因此有所提升。由于推掃式光譜儀不需要像擺掃式光譜儀一樣有外置掃擺裝置，體積較小，更加適合應用于生物醫學領域。綜合來看，無論是從成像質量還是成像效率出發，推掃式都相對更好一些，實用性更強。

凝視式成像方式與傳統相機類似，但一次性僅獲得目標在單個波段的空間信息，其采集的高光譜圖像的光譜分辨率通常低于其他采集掃描式獲取的圖像，常常無法實現高光譜分辨率的目標成像。由于凝視式高光譜儀內部沒有復雜的光路結構，體積較小，而且各譜段的圖像信息并非同一時刻掃描完成，因此它不適用于探測運動中的事物。凝視式每采集一個波段，需要二維濾波器如LCTF將原光譜濾波成一個窄帶光譜然后投射到探測器上，如圖1(c)所示。從某種意義上說，這種濾波方式可視為光譜維的推掃。相對于一維推掃式系統，凝視型濾波速度更快，避免使用復雜的機械設置。凝視式的獨特性在于掃描的是光譜維度，而成像的是空間維度，所以當需要對掃描的光譜信息進行后處理時，選擇凝視式更好。

②快照式高光譜成像方式

快照式高光譜成像方式無需掃描，能夠單次直接投射光譜數據到探測器上，如圖1(d)所示，一次性獲取目標物體的圖像信息和光譜信息。其內部不存在動態調節組件，具有抗干擾、快速成像的能力，因此適用于動態事物，可滿足實時監測的需求。一般此類系統依賴高光譜在空間上的冗余性，通過犧牲空間分辨率來增加光譜分辨率。如采用DMD來對空間信息進行調制，以復用光譜信息實現高光譜成像。此外，這類系統還需要使用復雜的還原算法對采集到的數據重建，需要消耗較長的計算時間才能獲得最終的高光譜顯微圖像。

圖1. 典型的幾種高光譜成像方式：(a) 擺掃式;(b) 推掃式;(c) 凝視型;(d) 快照型2.3. 可編程高光譜成像技術及光學染色的實現

可編程濾光系統

基于DMD的可編程濾光片由光柵、空間光調制器與會聚鏡三部分構成。空間光調制器采用數字微鏡器件DMD，充分利用其對空間光的靈活快速調制能力。與傳統液晶空間光調制器不同的是，其作為編碼孔徑器件可以充分發揮其高通量、高信噪比和靈活編碼的特點。該濾光片中合光衍射光柵用于反轉分光衍射光柵的色散過程，兩塊光柵具有相同的參數。

可編程高光譜顯微成像系統

可編程高光譜顯微成像系統與可編程濾光系統相比，添加了照明器件、顯微鏡以及計算機，如圖2所示。

一次像面出射的光經過物鏡后平行入射到分光衍射光柵將光譜進行色散，色散后的光譜經過會聚鏡聚焦到多頻帶光譜選擇器DMD平面，并形成色散光譜;DMD通過內部的每一個小鏡片不同角度的反轉，自由控制不同波段的光路通過，增強某些波長并抑制其他波長實現按照預先設置的光譜透過率進行光譜編碼調制;調制后出射的色散光譜經過會聚鏡平行入射到合光衍射光柵，經過鏡頭成像到探測器上，獲得濾光后的圖像。

圖2. 基于DMD的二維可編程高光譜顯微成像系統的示意圖

針對染色方法的研究，國內外大多機構尚且停留在研究傳統化學染色方法上，只有極少數剛剛開始對虛擬染色方法的探索。目前加州大學洛杉磯分校Ozcan研究團隊使用深度學習方法來對無標簽組織樣本進行虛擬染色，但與原圖像吻合率只達到92%左右。而國內現有采用深度學習對圖像進行染色處理的方法，僅僅是停留在對圖像的像素數據處理的層面，一般情況下吻合率85%，只有針對特殊挑選的數據集才能達到95%。目前這些研究還不能完全取代化學染色方法。本文介紹的可編程高光譜顯微成像系統，通過卷積神經網絡設計特定的光譜透過率，并利用可編程濾光系統實現該光譜透過率，通過增強目標背景區分度高的波段的透過率并抑制區分度低的波段，進而采集到等效于化學染色后樣本的顯微圖像。

對于可編程高光譜顯微成像系統，泛用性強的光譜透過率生成算法是決定最終光譜圖像中感興趣目標分類效果的核心因素。盡管基于DMD的可編程濾光片可以投射任意的非負光譜透過率，但只有線性的光譜透過率生成算法能實現單次采集圖像代替高光譜數據后處理的最終目標。目前，廣泛用于光譜數據處理的主成分分析(PCA)和線性判別分析(LDA)方法已被證明可以直接應用于光譜透過率的生成;此外，線性的卷積神經網絡算法也已應用于此可編程濾光系統。

基于主成分分析(PCA)和線性判別分析(LDA)相結合，推導了可編程光學濾波片光譜透過率的算法。文章分析了閉塞皮瓣和正常皮瓣的漫反射光譜，通過非負PCA方法從漫反射光譜數據中獲得前n個非負PCs，通過LDA模型壓縮到一維得到光譜透過率，理論分類精度達到98.04%。利用數值模擬在Salinas等數據集上對該方法進行了評估并與PCA-LDA方法對比，分類準確率達到96.71%，高于同數據集PCA-LDA方法95.58%的準確率，分類效果如圖3所示。

圖3. CNN分類效果3. 高光譜顯微成像技術在病理學檢測中的應用

近年來高光譜顯微成像在病理學檢測中得到了廣泛的應用。由于組織細胞的病理變化常常隨著內部成分的變化而變化，當入射光作用于病變組織并產生效應時，所探測到的光譜就會與正常組織細胞的光譜有所不同。因此可以實現無損、快速檢測病灶的目標。

癌細胞識別與探測

高光譜顯微成像技術可以幫助快速識別生物組織中癌細胞同時查看癌細胞在體內的分布情況,其依據原理是對組織切片中的正常細胞和癌細胞進行光譜采集，得到光譜和空間數據，并依此建立數學模型，對細胞種類進行鑒別，進而實現對癌細胞分布的可視化并且精準快速檢測癌細胞。利用高光譜成像技術對前列腺癌進行檢測，提取癌組織和正常組織的光譜特征，如圖4所示，使用最小二乘支持向量機對其進行分類，使高光譜圖像分類方法的靈敏性和特異性分別為92.8% ± 2.0%和96.9% ± 1.3%。Halicek [20] 等利用高光譜成像技術獲得的光譜信息對頭頸部腫瘤進行腫瘤邊緣分類，在鱗狀細胞癌與正常口腔組織中，其準確性、靈敏性和特異性分別為81%、84%和77%;在甲狀腺癌中，其準確性、靈敏性和特異性分別為90%、91%和88%。

皮膚疾病的檢測與診斷

2006年，Dicker等用高光譜顯微成像系統對用常規蘇木伊紅染色的良性和惡性皮膚組織標本進行成像，發現正常皮膚、良性病變和惡性黑色素瘤病變的光譜特征不同，如圖5所示，同時采用波形交叉相關分析方法對不同光譜進行分類，正確率超過85%。使用高光譜成像系統研究糖尿病患者以及正常人體前臂和腳的血紅蛋白飽和度，發現糖尿病人皮膚的血紅蛋白飽和度與正常人相比，略有減少。將高光譜成像用于預測糖尿病足潰瘍愈合的臨床研究中，HT指數預測愈合的靈感度、特異性、陽性和陰性預測值分別為93%、86%、93%和86%。在此基礎上，Yudovcky等 [24] 使用光譜范圍為450~700 nm的高光譜成像系統來評估糖尿病足潰瘍發展的風險和預測其愈合可能性。Seroul等 [25] 結合人體皮膚的整個可見光譜圖像對皮膚表皮厚度、黑色素體積分數、血液體積分數、血氧飽和度、膽紅素體積分數等五個參數進行了定量測量，并灰度標定這些參數，觀察皮膚的各種區域。

圖4. 典型小鼠中癌癥組織(虛線)和正常組織(實線)的光譜特征平均值

圖5. 來自三種不同組織的(左)病變區域和(右)正常區域的光譜特征的比較體內組織和器官疾病診斷

高光譜顯微成像廣泛地用于胃、腎以及動脈等體內組織和器官的疾病診斷。某團隊采集了手術切除胃組織的高光譜圖像，比較正常組織與癌變組織的光譜，發現了癌變組織與正常組織的光譜特征的不同，找到癌變組織的特征光譜，并將此波段數據輸入LS-SVM進行訓練，最終分類靈敏度與特異性達到了93%和91%。對高光譜圖像中胃組織切片的光譜信息進行分析以找到正常細胞和癌細胞光譜特征的不同，進行鑒別。應用高光譜成像系統對胃組織進行檢測，發現在600~800 nm范圍內腫瘤粘膜的平均光譜吸收率高于正常粘膜組織，利用腫瘤目標識別算法對光譜信號進行評價和分類，分別獲得了78.8%、92.5%、85.6%的靈敏度、特異性和檢測準確率。對胃組織進行高光譜成像并獲取組織的光譜信息用于區分腫瘤與正常粘膜。

結語

本文主要闡述了高光譜顯微成像技術及其在病理學檢測中的應用，此外還介紹了一種新型的可編程高光譜顯微成像技術及其所實現的光學染色功能。目前，受制于化學染色的局限性，難以實現高效的病理學檢查，利用高光譜顯微成像技術，可對病理組織切片進行無損和快速成像，同時獲得光譜信息，在對高光譜顯微圖像進一步數據處理后，可獲取關于病理組織切片的生理、生化信息，進而實現快速、準確的病理診斷。

隨著壓縮感知技術的發展和微機電系統制造能力的提升，利用DMD的光調制特性對目標圖像進行頻譜編碼可以提高高光譜成像系統數據采集效率，減少計算量。然而該方法在應用過程中也存在著不足。一方面，應用DMD的卷積方式只能對圖像光譜信息進行線性分類且無法實現卷積操作中負的權重值;其次，圖像采集的速度受DMD微鏡偏轉速度的限制。因此，高光譜成像未來的研究重點應是尋求在光譜數據分類過程中更有針對性更高效的數據降維方法，來減少分類過程中的計算量并提高算法的泛化能力和可理解性，來提高分類效果。最后，在病理學檢測領域的光學染色中利用高光譜顯微成像技術結合CNN網絡以及可編程濾光片對光學信號進行處理較少。今后應建立更加完整的高光譜數據庫，進一步探索對各種生物組織的染色工作。